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Jun 04, 2023

Einfluss der Fc-Kernfucosylierung und des Leichtketten-Isotyps auf die IgG1-Flexibilität

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 237 (2023) Diesen Artikel zitieren 847 Zugriffe auf 3 Altmetric Metrics-Details N-Glykosylierung spielt eine Schlüsselrolle bei der Modulation der Bioaktivität von monoklonalen

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 237 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die N-Glykosylierung spielt eine Schlüsselrolle bei der Modulation der Bioaktivität monoklonaler Antikörper (mAbs), und der Isotyp der leichten Kette (LC) kann ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften beeinflussen. Aufgrund der sehr hohen Flexibilität dieser Biomoleküle ist die Untersuchung des Einflusses solcher Merkmale auf das Konformationsverhalten von mAbs jedoch eine große Herausforderung. In dieser Arbeit untersuchen wir mittels beschleunigter Molekulardynamik (aMD) das Konformationsverhalten von zwei kommerziellen Immunglobulinen G1 (IgG1), repräsentativ für κ- und λ-LCs-Antikörper, sowohl in ihrer fucosylierten als auch in ihrer afucosylierten Form. Unsere Ergebnisse zeigen durch die Identifizierung einer stabilen Konformation, wie die Kombination aus Fucosylierung und LC-Isotyp das Gelenkverhalten, die Fc-Konformation und die Position der Glykanketten moduliert, alles Faktoren, die möglicherweise die Bindung an die FcγRs beeinflussen. Diese Arbeit stellt auch eine technologische Weiterentwicklung in der Konformationserforschung von mAbs dar und macht AMD zu einem geeigneten Ansatz zur Klärung experimenteller Ergebnisse.

Bei den meisten klinisch verfügbaren monoklonalen Antikörpern (mAbs) handelt es sich um Immunglobulin G1 (IgG1)1, da sie im Vergleich zu anderen IgG-Unterklassen eine höhere Stabilität und starke Effektorfunktionen aufweisen. mAbs bestehen aus drei Domänen: zwei Fragment-Antigen-Bindungsdomänen (Fab) und einem kristallisierbaren Fragment (Fc), einschließlich schwerer und leichter Ketten (HC bzw. LC), die beide variable und konstante Regionen enthalten. Die variablen Domänen sind für die adaptive Immunantwort oder, im Fall kommerzieller mAbs, für die selektive Bindung eines Zielantigens verantwortlich. Antikörper können zwei verschiedene Isotypen von LC präsentieren, nämlich κ und λ2. Das Verhältnis von Antikörpern, die κ- oder λ-LCs enthalten, schwankt erheblich zwischen den Spezies3 und angesichts der etwa 100 zugelassenen therapeutischen mAbs enthalten nur wenige ein λ-LC4. Es wurden nur wenige Studien zum funktionellen und strukturellen Vergleich zwischen diesen beiden Isotypen veröffentlicht, was auf Unterschiede in der Kooperativität und Flexibilität der Fab-Domänen5 sowie in den strukturellen Eigenschaften der komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs)6 schließen lässt. Die Fähigkeit von IgG1s, das Immunsystem durch die Interaktion des Fc mit spezifischen Fcγ-Rezeptoren (FcγR) zu aktivieren, wird als Schlüsselaspekt angesehen, der auch durch N-Glykosylierung am konservierten Asn297 im Fc7,8 reguliert wird. Veränderungen in der Länge, Zusammensetzung und Ladung der Glykane können sich auf die strukturelle Integrität und Konformation der Fc-Domäne auswirken, wodurch sich die Bindungsaffinität zu FcγRs verändert und die Immunantwort beeinflusst9,10. Insbesondere kann die Kernfucosylierung die Antikörper-abhängige Zellzytotoxizität (ADCC) beeinflussen, da sie die Bindungsaffinität von IgG1 an FcγRIIIa (einen aktivierten Rezeptor mit geringer Affinität) verringert1,11,12,13,14,15,16, 17.

Trotz dieser Beobachtungen wurde die strukturelle Rolle von LC-Unterschieden bei der Modulation des Funktionsverhaltens dieser Biomoleküle, sowohl im Hinblick auf die Antigenerkennung als auch auf die Aktivierung der Effektorfunktion, nie untersucht. Einige Studien18,19 haben Hypothesen vorgeschlagen, um den Fucosylierungseffekt auf die Effektorfunktionen zu erklären, wobei sie sich jedoch nur auf Fc konzentrierten, ohne die Rolle der Gelenk- und Fab-Domänen zu berücksichtigen. In unserer vorherigen Arbeit20 haben wir vorgeschlagen, dass die Anwesenheit von Fucose das Konformationsverhalten des gesamten mAb modulieren kann, was zu einer Präferenz für eine T-förmige Konformation führt, die im Prinzip weniger für die Rezeptorbindung geeignet ist. In Übereinstimmung mit unseren vorherigen Ergebnissen haben Spiteri et al. haben durch einen Vergleich von glykosyliertem und aglykosyliertem IgG1 gezeigt, wie Glykane strukturelle Einschränkungen einführen können. Diese Arbeit zeigt, dass die Entfernung von Glykanen die Fab-Fc-Trennung beeinflusst, indem die Flexibilität des Proteins moduliert wird, der Antikörper einen anderen Konformationsraum erkunden kann und die Bindung an FcγRs21 beeinflusst wird. In dieser Arbeit untersuchen wir die Rolle der Fucose und der beiden LC-Isotypen im Strukturverhalten von IgG1s, indem wir einen innovativen In-silico-Ansatz für mAbs verwenden, der auf einer Kombination aus klassischen und beschleunigten Molekulardynamiksimulationen (cMD bzw. aMD) basiert ). Es wurde ein Vergleich zwischen der afucosylierten (G0) und der fucosylierten (G0F) Form von Adalimumab und Avelumab durchgeführt, zwei kommerziellen IgG1s, die gute Modelle für κ- und λ-LCs-Antikörper sind, was auf eine Schlüsselrolle von λ-LCs bei der Modulation der Dynamik von hindeutet IgG1. Nach unserem besten Wissen wurde die Kombination aus Standard- und erweiterten Probenahme-MD-Methoden nie im Zusammenhang mit dem Konformationsverhalten von mAbs verwendet. Dementsprechend können unsere Ergebnisse den Weg für neue zukünftige Perspektiven (experimentell und rechnerisch) bei der Untersuchung der Antikörperflexibilität ebnen.

Für Adalimumab und Avelumab wurden chimäre 3D-Modelle erstellt, die als gute Modelle der κ- und λ-Isotypen ausgewählt wurden, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben. Die Auswahl dieser beiden kommerziellen mAbs als Fallstudie erfolgte gemäß einem Sequenz-Alignment, das im Ergänzungsmaterial (Ergänzende Abbildung 1) gezeigt ist. Zwei afucosylierte (Adalimumab G0, Avelumab G0) und zwei fucosylierte (Adalimumab G0F, Avelumab G0F) Modelle wurden erhalten und über cMD für insgesamt 3 µs simuliert (drei 1 µs lange Replikate). Eine schematische Darstellung der in dieser Studie verwendeten Glykane ist in der ergänzenden Abbildung 2 gemäß dem Schema der Symbolnomenklatur für Glykane (SNFG)22 dargestellt. In diesen Systemen verhindert das Vorhandensein der Scharnierregion, eines flexiblen Linkers, der alle Domänen verbindet und dabei mindestens vier Freiheitsgrade (θ und ϕ für jedes Fab) lässt, die Konvergenz der quadratischen Mittelabweichung (RMSD) und der RMS-Fluktuation ( RMSF), die wenig aussagekräftig sind. In ergänzenden Abbildungen. In den Abbildungen 3–5 werden die für C-Alpha-Atome berechneten RMSD-, RMSF- und Rg-Diagramme dargestellt, die zeigen, dass alle Systeme nach 300 ns cMD den Zustand hoher Schwankungen der geometrischen Parameter verlassen, selbst wenn keines von ihnen eine Quelle erreicht -definierter Plateauzustand dieser Deskriptoren. Dementsprechend konzentrierte sich die Analyse auf die Variation des θ-Winkels in den letzten 7000 Bildern. Dieser Winkel stellt, wie bereits gezeigt20, die Neigung von Fab-Domänen dar, sich dem Fc anzunähern, was die Klassifizierung von Y- (θ < 85°) oder T-förmigen (θ ≥ 85°) Konformationen ermöglicht. Abbildung 1a zeigt eine klare Tendenz von G0F-Adalimumab, in einer T-förmigen Konformation zu bleiben, da beide Fab 30 % der Zeit einen θ ≥ 85° aufweisen. Dieser Trend ist bei G0-Adalimumab umgekehrt, das bis zu 50 % der Zeit dazu neigt, eine Y-förmige Konformation anzunehmen. Im Gegensatz dazu zeigt Avelumab keine signifikanten Unterschiede zwischen den G0- und G0F-Spezies, beide scheinen jedoch eine Y-förmige Ausrichtung zu bevorzugen. Darüber hinaus weisen alle untersuchten Biopolymere ein asymmetrisches Verhalten auf, mit einer unterschiedlichen Verteilung der θ-Werte, die einzelne Fab-Domänen entlang der Flugbahn annehmen (Abb. 1b). Auf diese Konformationsmerkmale wurde durch eine Clusteranalyse hingewiesen, die eine klare Y-förmige Konformation für G0-Adalimumab, G0- und G0F-Avelumab und eine T-förmige Konformation für G0F-Adalimumab zeigte (Abb. 1c).

ein Balkendiagramm, das den Prozentsatz der Frames zeigt, in denen die θ-Winkel beider Fab-Domänen gleichzeitig Werte ≥ oder <85° aufweisen. b Balkendiagramm, das den Prozentsatz der Frames zeigt, in denen der θ-Winkel jeder Fab-Domäne ≥85° beträgt. c Medoide des am stärksten besiedelten Clusters, identifiziert für jeden mAb mit den entsprechenden θ-Werten. d Boxplots der Abstandsverteilung der CH2-Domänen für jeden mAb. Die in (a, b und d) gezeigten Diagramme wurden durch Zusammenführen von drei Replikaten für jedes System mit n = 21.000 Frames für jede Bedingung erstellt.

Basierend auf den Beweisen, dass das Vorhandensein einer offenen oder geschlossenen Fc-Konformation mit einer höheren oder niedrigeren FcγR-Bindungsaffinität in Verbindung gebracht werden kann23, wird über eine Analyse des Abstands zwischen CH2-Domänen berichtet. Die Ergebnisse (Abb. 1d) zeigen, dass Adalimumab G0F einen geringeren Medianwert (3,1 nm) und daher eine geschlossene Fc-Domäne aufweist als Adalimumab G0 (4,8 nm), wie in unserer vorherigen Arbeit berichtet20. Avelumab-Arten zeigen stattdessen sehr ähnliche Verteilungen mit Medianwerten von 3,7 nm (G0) und 4,1 nm (G0F), vergleichbar mit Adalimumab G0, was die Hypothese eines sehr ähnlichen Verhaltens von Avelumab-Formen stützt. Wie in den nächsten Absätzen gezeigt wird, war die cMD jedoch nicht effizient genug, um den Konformationsraum der λ LC IgG1s zu erkunden.

Um das Konformationsverhalten aller untersuchten Spezies weiter zu untersuchen und zu charakterisieren, wurden 1 μs lange AMD-Simulationen durchgeführt. Bei dieser Methode wird dem System ein Vorspannungspotential hinzugefügt, das sowohl die potentielle Energie als auch die Diederwinkel stört und die Konformationsänderungen beschleunigt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung eines größeren Bereichs der freien Energieoberfläche (FES) des Moleküls im Vergleich zu einem cMD und ermöglicht so auch die Untersuchung von Konformationszuständen, die bei den cMD-Simulationen nicht beobachtet wurden.

Das Profil der freien Energie entlang Theta1 (θ-Winkel zwischen Fab1 und Fc) und Theta2 (θ-Winkel zwischen Fab2 und Fc) wurde berechnet, um die durchschnittliche Kraft aller möglichen Konfigurationen jedes Systems zu erhalten (Abb. 2). Diese Analyse ermöglichte die Identifizierung einer Region des FES mit einem minimalen Potenzialwert der mittleren Kraft (PMF < 0,5 kcal/mol). Die Ergebnisse zu G0- und G0F-Adalimumab bestätigen das bei cMD beobachtete Verhalten, mit einer bevorzugten Y-förmigen Konformation für G0-Adalimumab (θ ≈ 70° für beide Fab) und einer T-förmigen Konformation für G0F-Adalimumab (θ > 90° für beide Fab). ), wie in Abb. 2 dargestellt. Im Gegensatz dazu neigen sowohl G0 als auch G0F Avelumab dazu, eine T-förmige Konformation zu erreichen, mit θ > 90° in mindestens einem Fab in G0 Avelumab und in beiden Fab-Domänen in G0F Avelumab . Dieser Analyse zufolge wird die Rolle von Fucose bei der Förderung der T-förmigen Konformation für beide Isotypen bestätigt. Andererseits wurde eine mutmaßliche Rolle des λ LC bei der Förderung einer T-förmigen Konformation, selbst in Abwesenheit von Fucose, herausgefunden. Darüber hinaus verdeutlichen diese Ergebnisse, insbesondere für Avelumab, die Grenzen der cMD-Methoden bei der Erforschung großer Konformationsräume solch flexibler Proteine. Gleichzeitig eröffnet aMD die Identifizierung anderer Deskriptoren, die eine gründliche Untersuchung des Konformationsverhaltens ermöglichen. Ausgehend von diesen Ergebnissen konzentrierten sich die folgenden Analysen auf die Rahmen und die entsprechenden Konformationen, die im identifizierten Energieminimum enthalten sind, da der Zweck der AMD-Simulationen darin bestand, Strukturen mit minimaler Energie zu identifizieren.

Das freie Energieprofil (nach Neugewichtung) der vier Antikörper entlang der Theta1- und Theta2-Winkel mit der molekularen Oberfläche medoider Strukturen, die durch Clusteranalyse aus dem Bereich minimaler Energie (in dunkelrot) isoliert wurden. Der Farbbalken stellt den PMF-Wert in kcal/mol dar. Schwarze gestrichelte Kreise zeigen den mit cMD-Simulationen untersuchten Konformationsraum, der für Avelumab im Vergleich zu dem über aMD erfassten begrenzt ist.

Unter den verschiedenen Deskriptoren, die wir zur Analyse des Verhaltens simulierter mAbs verwendeten, wurden die ϕ-Winkel berechnet, um die Rotationsbewegungen von Fab-Domänen zu beschreiben. Δϕ wurde berechnet, um die Verschiebung jedes Fab in Bezug auf seine Startposition zu bestimmen, wie in Gleichung (1) formalisiert. (1).

Dabei ist i der i-te Frame der Flugbahn und 0 der Startframe.

Während es bei den κ-Antikörpern dementsprechend nur zu einer geringen Verschiebung der Fab-Domänen kommt (Abb. 3), zeigen λ-Fab eine höhere Rotationsanfälligkeit (mindestens 100° Verschiebung), selbst wenn sie asymmetrisch sind. An den Gesamttrajektorien wurde eine wesentliche Dynamik durchgeführt, um die unterschiedliche Rotationsneigung der beiden Isotypen zu erklären. Diese Analyse zeigte, dass Adalimumab und Avelumab von unterschiedlichen Hauptbewegungen beeinflusst werden und durch Berechnung des Δϕ entlang der Richtung der ersten beiden Eigenvektoren die Verteilung dieses Werts mit der auf der gesamten Trajektorie berechneten vergleichbar ist. Dies legt nahe, dass die unterschiedliche Rotationsneigung eine intrinsische Eigenschaft der beiden Isotypen ist. In der ergänzenden Abbildung 6 ist das normalisierte PC-Diagramm dargestellt, das die statistische Signifikanz der Berücksichtigung der ersten beiden Eigenvektoren zeigt.

Fab1- und Fab2-Δϕ-Verteilung in κ (a) und λ (b) mAbs, berechnet für die Frames im Energieminimum und entlang der Richtung der ersten beiden Eigenvektoren, isoliert von den gesamten Trajektorien. Dichtediagramme zeigen, dass es in jedem Antikörper mindestens einen Eigenvektor gibt, der die Rotationen von Fab-Domänen erklären kann.

Im Zusammenhang mit Fc-Deskriptoren wurde auch ein unterschiedliches Verhalten zwischen κ und λ festgestellt. Bei der Berechnung des Abstands zwischen CH2-Domänen (Abb. 4a) wurde wie bei den cMD-Simulationen beobachtet, dass κ-mAbs eine offene Fc-Konformation mit CH2-Abstandswerten im globalen Bereich zwischen 4 und 6 nm bevorzugen, während die λ-mAbs eine geschlossene Fc-Struktur bevorzugen , mit CH2-Abständen zwischen 2 und 4,5 nm. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die Fc-Domäne in G0F-Spezies tendenziell in einer geschlosseneren Konformation bleibt als in G0, was bereits früher berichtet wurde20. Diese Daten stimmen mit der in Abb. 4b dargestellten Analyse des Mindestabstands zwischen Kohlenhydratketten überein und zeigen, dass die fucosylierten Glykane unabhängig vom LC-Isotyp im Fc-Hohlraum bleiben und die geschlossene Fc-Konformation fördern. Andererseits bleiben G0-Glykane lieber außerhalb des Fc und in großem Abstand. In Abb. 4c wird berichtet, dass Medoidstrukturen von Fc-Domänen die Position von Glykanen in Bezug auf den Fc-Hohlraum hervorheben.

Dichtediagramm der CH2-Abstandsverteilung (a) und des Mindestabstands zwischen Glykanketten (b) für jeden mAb. c Strukturelle Überlagerung repräsentativer Fc-Strukturen, die aus Medoiden isoliert wurden und die unterschiedliche Position von G0- (intern) und G0F-Glykanen (extern) zeigen.

Gemäß den oben beschriebenen Ergebnissen wurden zwei Effekte beobachtet, die das Antikörperverhalten modulieren: der „LC-Effekt“, der hauptsächlich die Fab-Rotation und die Fc-Öffnung beeinflusst, und der „Fucosylierungseffekt“, der sich hauptsächlich auf das Y/T auswirkt -förmige Konformation und die Position der Glykane innerhalb/außerhalb der Fc-Spalte. Unter Berücksichtigung der entscheidenden Rolle der Gelenkregion für die Flexibilität der mAbs wurden zur Untersuchung des „LC-Effekts“ die Kontakte zwischen den schweren Atomen der letzten sechs (für Adalimumab) bzw. sieben (für Avelumab) C-terminalen Reste von LC und dem Gelenk untersucht berechnet, was aufgrund der unterschiedlichen Sequenzzusammensetzung eine unterschiedliche Haltung der beiden Isotypen beim Herstellen von Kontakten mit dem Gelenk zeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass G0-Adalimumab (Abb. 5a, linkes Feld) eine höhere Anzahl an Wechselwirkungen aufweist als G0-Avelumab (Abb. 5b, linkes Feld), wobei Arg211 eine Schlüsselrolle spielt, was wahrscheinlich auf die Merkmale der Substitutionen in dieser Region zurückzuführen ist ( Ergänzende Abbildung 1) und zur Insertion von Ser216 in λ-LCs. Betrachtet man stattdessen die G0F-Antikörper, so zeigt sich der Effekt der Fukosylierung in einer zunehmenden Anzahl von Kontakten für beide mAbs, insbesondere in den letzten 2–3 Resten, zu denen für Adalimumab Glu213 und Cys214 gehören (Abb. 5a, rechtes Feld), während für Avelumab Glu214, Cys215 und Ser216 (Abb. 5b, rechtes Feld). Im Gegensatz zu G0-Spezies führt die Kombination von LC- und Fucosylierungseffekten zu einem starken Anstieg der Anzahl von Kontakten, die Ser216 in G0F-Avelumab herstellt, was sowohl auf eine Anfälligkeit dieses Rests für das Vorhandensein von Fucose als auch auf eine Rolle bei der Modulation von Fucose schließen lässt Scharnierflexibilität. In Abb. 5c ist eine schematische Darstellung der strukturellen Nähe zwischen C-terminalen LC-Resten und Scharnieren in G0-Antikörpern dargestellt, während in der ergänzenden Abb. 7 die Darstellung von G0F-mAbs gezeigt ist. Insgesamt könnte die bei Avelumab beobachtete geringere Anzahl an Kontakten zwischen C-terminalem LC und Gelenk auch die unterschiedliche Rotationsneigung (Δϕ) der beiden Antikörperspezies unterstützen, ein Aspekt, der in Zukunft weiter untersucht wird.

Boxdiagramme, die die Verteilung der Anzahl der Kontakte zwischen C-terminalen LC-Resten und Scharnier in Adalimumab (a) und Avelumab (b) zeigen. Die Anzahl der in diesen Analysen berücksichtigten Frames beträgt: n = 2649 für Adalimumab G0, n = 3440 für Adalimumab G0F, n = 3170 für Avelumab G0, n = 4110 für Avelumab G0F. Strukturdarstellung von G0 Adalimumab (c) und Avelumab (d), um die strukturelle Nähe zwischen C-terminalen LC-Resten und dem Gelenk hervorzuheben. Die Sekundärstruktur der Fab-Domänen ist als Linie dargestellt, die LC-Reste sind als Stäbchen dargestellt und die molekulare Oberfläche des Scharniers ist grau dargestellt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird Fc nicht angezeigt.

Um den Fucosylierungseffekt zu bewerten, wurden die H-Brücken-Wechselwirkungen zwischen Glykanen und dem entsprechenden Antikörper berechnet. Eine Matrix, die die Anzahl der an diesen Bindungen beteiligten Reste zeigt, ist in den Abbildungen dargestellt. 6–7 (Tafeln A). Diese Analyse zeigt, dass (i) G0F-Ketten mehr Kontakte herstellen als G0-Ketten; (ii) Im Gegensatz zu dem, was bei Wechselwirkungen zwischen schweren Atomen beobachtet wurde, stellen G0-Glykane in Avelumab mehr Kontakte her als in Adalimumab und einige dieser Bindungen beinhalten LC-Reste, nämlich: Lys153, Gly156 und Thr209; (iii) In beiden G0F-mAbs interagieren Glykane direkt mit dem Scharnier (Avelumab) oder mit nahe gelegenen Resten (Adalimumab), was unsere Hypothese stützt, dass die Fucose durch Modulation der Scharnierflexibilität eine strukturelle Einschränkung einführt und die Präferenz für eine T-Form erhöht Konformation. In Abb. In den Abbildungen 6–7 (Panels B) wird eine Zusammenfassung der wichtigsten Wechselwirkungen zwischen Glykanen und Antikörpern gezeigt, mit besonderem Augenmerk auf die Reste von LC (G0 Avelumab) und die Gelenkreste. In den Ergänzungstabellen 1–4 sind alle gefundenen Wechselwirkungen mit der zugehörigen Häufigkeit in den Mindestenergierahmen aufgeführt.

ein Punktdiagramm, das die spezifischen Wechselwirkungen der G0- und G0F-Ketten mit Adalimumab mit einem spezifischen Farbcode für HC1, HC2 und LC1 zeigt. Strukturelle Darstellung der wichtigsten H-Bindungen, die zwischen Zuckern und G0 (b) und G0F (c) Adalimumab identifiziert wurden. Die Sekundärstruktur wird als Bänder dargestellt, die Hauptreste als gelbe Stäbchen und die molekulare Oberfläche von Zuckern wird in Grau und Dunkelrot (Fucose) dargestellt.

ein Punktdiagramm, das die spezifischen Wechselwirkungen der G0- und G0F-Ketten mit Avelumab mit einem spezifischen Farbcode für HC1, HC2 und LC2 zeigt. Strukturelle Darstellung der wichtigsten H-Bindungen, die zwischen Zuckern und G0 (b) und G0F (c) Avelumab identifiziert wurden. Die Sekundärstruktur wird als Bänder dargestellt, die Hauptreste als gelbe Stäbchen und die molekulare Oberfläche von Zuckern wird in Grau und Dunkelrot (Fucose) dargestellt.

Für alle simulierten Systeme wurde eine Analyse der Konformationsvariabilität von Zuckerketten unter Berücksichtigung der minimalen Energierahmen durchgeführt. Erstens wurde die Probenahme der korrekten φ- und ψ-Diederwinkel, die für jedes Zuckerpaar identifiziert wurden, überprüft, da eine verbesserte Probenahmemethode wie das aMD verwendet wurde. Die Winkel wurden gemäß der Definition von Wormald MR und Kollegen24 identifiziert. Ergänzende Abbildungen. 8–10 berichten über die Verteilung der Diederwerte für jedes Zuckerpaar in G0- und G0F-Systemen im Vergleich zu Werten, die aus experimentell gelösten Strukturen von Glykoproteinen erhalten wurden24. Dementsprechend stimmt die Abtastung der Dieder in allen Systemen mit ihrem zulässigen Bereich überein. Dieses Ergebnis validiert die Verwendung von aMD mit dem CHARMM36-Kraftfeld für die in dieser Arbeit untersuchten Glykane. Um die Position von Glykanen in Y- und T-förmigen Konformationen weiter zu bewerten, wurde der Abstand zwischen dem Massenschwerpunkt (com) jeder Glykankette und sich selbst in Bezug auf die Fc-Position berechnet. Die Verteilung der Abstandswerte ist in der ergänzenden Abbildung 11 dargestellt und bestätigt, was bereits mit dem berechneten Mindestabstand zwischen den Glykanketten A und B in jedem Antikörper beobachtet wurde (Abb. 4b): G0-Ketten sind flexibler als G0F-Ketten und untersuchen eine größere Konformation Raum, wie die höheren Distanzwerte zeigen. Darüber hinaus ist das Verhalten der beiden Oligosaccharide in Avelumab etwas ähnlicher, was auf eine geringere Flexibilität auch für G0-Ketten hindeutet, was wahrscheinlich auf die T-förmige Konformation zurückzuführen ist, die der Antikörper selbst in Gegenwart von G0-Glykanen annimmt. Diese Analyse wurde weiter in eine Clusteranalyse integriert, die zur Beschreibung der Dynamik von Zuckern nützlich ist. Die fünf repräsentativsten Glykanstrukturen, die für jede Kette in jedem Antikörper identifiziert wurden, sind in der ergänzenden Abbildung 12 mit dem zugehörigen Prozentsatz der Clusterpopulation aufgeführt. Infolgedessen weisen alle Glykane eine gewisse Variabilität zwischen den Clustern auf, was erwartungsgemäß auf eine höhere Flexibilität dieser Moleküle gegenüber dem Protein schließen lässt. Andererseits bestätigt diese Analyse, dass sich Glykane aufgrund der Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Fucose außerhalb oder innerhalb der Fc-Höhle befinden und nicht aufgrund der Antikörperform Y oder T. Darüber hinaus gilt, wenn in Adalimumab das Verhalten von G0 und G0F-Glykane scheinen auch die unterschiedliche Form des Antikörpers zu beeinflussen, bei Avelumab sind diese Aspekte unabhängig voneinander. Tatsächlich nimmt G0 Avelumab eine T-förmige Konformation an, selbst wenn Glykane dazu neigen, außerhalb des Fc zu bleiben, was auf andere Weise auf die Rolle des LC-Isotyps bei der Modulation der Antikörperdynamik hindeutet.

Unser Ziel war es, mithilfe von In-silico-Methoden das Verhalten von therapeutischem IgG1 mit κ- und λ-LCs zu untersuchen und dabei Strukturmerkmale zu identifizieren, die zur Vorhersage ihres Konformationsverhaltens und ihrer Bioaktivität nützlich sind, sowie erstmals eine Struktur mit minimaler Energie. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste In-silico-Studie, die auf den Vergleich dieser beiden IgG1-Isotypen abzielt. Dabei werden sowohl Proteine ​​in voller Länge berücksichtigt als auch verschiedene MD-Ansätze kombiniert: cMD- und aMD-Simulationen. Zwei Vertreter der κ- und λ-IgG1-LCs, Adalimumab und Avelumab, in ihren G0- und G0F-Formen wurden untersucht und zwei Effekte beobachtet, die sich auf die Flexibilität der mAbs auswirken: der „Fucosylierungseffekt“, der bereits ausführlich beschrieben wurde1,11,12 ,13,15,16,17 und der „LC-Effekt“, über den wir hier zum ersten Mal berichten. Wie bereits in unserer früheren Arbeit20 angenommen und im Einklang mit der von Spiteri et al.21 nachgewiesenen Rolle der Glykosylierung bei der Beeinflussung der Flexibilität von IgG1, wirkt sich der „Fucosylierungseffekt“ auf die Y/T-förmige Konformationspräferenz und auf die Position von Glykanen aus innerhalb/außerhalb des Fc. Stattdessen wurde festgestellt, dass der „LC-Effekt“ die Fab-Rotation und die Fc-Öffnung moduliert und zur Stabilität der Y/T-förmigen Konformation beiträgt, was auf einen weiteren Faktor bei den Konformationsmerkmalen dieser Biomoleküle schließen lässt. Beide Effekte wirken sich gegen die Scharnierflexibilität aus und sind entscheidend für die Konformationsneigung des Antikörpers. Basierend auf den Ergebnissen können wir Folgendes zusammenfassen: (i) Unter Berücksichtigung der G0-Formen kann der LC bei Adalimumab mit dem Gelenk interagieren und dessen Flexibilität modulieren, bei Avelumab fehlen diese Wechselwirkungen aufgrund der Unterschiede in der Aminosäurezusammensetzung. Dies führt zu einer unterschiedlichen Fab-Rotationsneigung der beiden Isotypen (Δϕ-Winkelverteilung); (ii) Unter Berücksichtigung der G0F-Formen kommt es bei beiden Antikörpern zu einem Anstieg der Interaktionszahl sowohl zwischen LC und Gelenk als auch zwischen Zuckern und dem Protein. G0F-Zuckerketten interagieren direkt mit den Scharnier- oder Nahresten und führen zu einer strukturellen Einschränkung im Molekül. Dies bestätigt den bereits vermuteten Effekt, der durch Fucose auf die Scharnierflexibilität vermittelt wird; (iii) Die Wirkung von Fucose ist unabhängig vom LC-Isotyp vorhanden, in G0F Avelumab ist sie jedoch verstärkt, da sie mit der Wirkung von λ LC aufgrund der Zunahme der Anzahl von Kontakten zwischen dem C-terminalen Cys214, Glu215 und kombiniert wird Ser216 und das Scharnier; (iv) Der „LC-Effekt“ trägt stark zum Konformationsverhalten von G0 Avelumab bei, wobei LC-Reste an Wechselwirkungen mit Zuckern beteiligt sind und nicht wie bei Adalimumab mit dem Gelenk. Dies stützt die Hypothese, dass die Unterschiede in der Sequenzzusammensetzung von LC das Verhalten von IgG1 beeinflussen könnten, eine T-förmige Konformation fördern und wahrscheinlich die Affinität von λ LC IgG1s für FcγRIIIa verringern könnten. Folglich ist unsere Hypothese, dass der Einfluss der Fucosylierung auf die ADCC-Aktivität von λ LC IgG1s geringer sein könnte als der von κ LC IgG1s. Unsere Ergebnisse zum LC-Effekt stimmen tatsächlich stark mit der experimentellen Studie von Shen et al.25 überein. Nach der Deletion des C-terminalen Ser in λ LC, das in κ fehlt, beobachteten die Autoren nicht nur eine Erhöhung der Stabilität des Moleküls bei hohen pH-Werten, sondern auch eine Zunahme der ADCC-Reaktion, was darauf hindeutet, dass dies der Fall ist Rückstände können zu einer beeinträchtigten IgG1-Funktionalität führen. Andererseits wurde die strukturelle Rolle von Fucose bei der Modulation der Präferenz von IgG1 für eine T-förmige Konformation, die wir bereits vermutet20, durch die Wechselwirkungen zwischen Zuckern und dem Gelenk weiter bestätigt und erklärt. Die Implementierung von aMD ermöglichte es uns tatsächlich, Regionen des Antikörper-FES und Konformationen zu untersuchen, die mit klassischen Methoden nicht beobachtet wurden.

Die Kombination von cMD und aMD stellt einen großen Fortschritt im tiefen Verständnis der molekularen Mechanismen dar, die das Konformationsverhalten dieser Molekülklasse regulieren. Dieser Ansatz, der noch nie im Zusammenhang mit mAbs verwendet wurde, könnte weiter umgesetzt werden, um die Wissensbasis über die Wirksamkeit und Stabilität von mAbs zu erweitern und die Erkenntnisse zum Wirkmechanismus dieser Klasse von Biotherapeutika besser zu untermauern.

Diese Studie legt auch die Grundlagen für neue Ansätze zur Modulation der IgG1-Dynamik fest und eröffnet neue Perspektiven im Kontext der auf die Antikörperentwicklung angewendeten Gentechnik. Unsere Ergebnisse unterstreichen tatsächlich die Relevanz einer sorgfältigen Berücksichtigung des LC-Isotyps bei der Entwicklung neuartiger Biotherapeutika. Zukünftige In-silico-Proteindesignansätze und Mutageneseexperimente werden nützlich sein, um die Rolle von LC bei der Flexibilität und Aktivität von Antikörpern zu validieren.

Um gute Vorlagen für unseren Zweck zu identifizieren, wurde ein Sequenz-Alignment zwischen 20 humanen kristallisierten κ, 16 humanen kristallisierten λ und 26 vermarkteten vollständig humanen IgG1s (21 κ und 5 λ) durchgeführt (Ergänzende Anmerkung 1 und ergänzende Abbildung 1). Die humanen kristallisierten IgG1-Fab-Domänen wurden mit dem in MOE 2020.0126 enthaltenen Tool „Antibody Search“ ausgewählt, während die vermarkteten Moleküle von der Website „The Antibody Society27“ ausgewählt und ihre Primärsequenzen von DrugBank28 importiert wurden. Das Tool „Protein Align“ von MOE wurde verwendet, um das Mehrfachsequenz-Alignment mithilfe einer BLOSUM62-Matrix durchzuführen.

Die atomistischen Modelle von Adalimumab und Avelumab wurden mit dem gleichen chimären Homologiemodellierungsansatz mit dem „Homology Model“-Tool der MOE-Software erstellt26. Die kristallographischen Strukturen sowohl der Adalimumab- als auch der Avelumab-Fab-Domänen sind verfügbar (PDB-IDs: 3WD5 bzw. 4NKI)29,30 und wurden zu deren Modellierung verwendet, während die einzige gelöste Struktur eines gesamten menschlichen IgG1 als Vorlage verwendet wurde (PDB-ID). : 1HZH)31 zum Bau von Scharnier- und Fc-Teilen. Die von uns gewählte Struktur von 1HZH ist diejenige, die in der MOE-Bibliothek kristallisierter Antikörper enthalten ist und von MOE-Experten mit MD-Simulationen verarbeitet wurde. Diese Wahl ergibt sich aus der Notwendigkeit, für die Antikörper dieselbe Ausgangskonformation zu verwenden, um durch Glykane vermittelte Unterschiede aufzuzeigen. Vor der Durchführung der Homologiemodellierung wurden alle Vorlagen mit dem Tool „Strukturvorbereitung“ von MOE vorbereitet, um etwaige kristallographische Probleme zu korrigieren, und mit dem Tool „Protonate 3D“ verarbeitet, um die Ionisierungszustände zuzuordnen und fehlende Wasserstoffe hinzuzufügen. Sowohl die 3WN5- als auch die 4NKI-Struktur weisen einige fehlende Reste auf. Die letzten drei C-terminalen Reste im LC von 3WD5 (Gly212, Glu213 und Cys214) wurden auf 1HZH.pdb mit der aktivierten Option „Vorlage überschreiben“ modelliert. In 4NKI fehlten die ersten (Gln1) und die letzten drei (Glu214, Cys215 und Ser216) Aminosäuren des LC. Gln1 wurde manuell über das Tool „Protein Builder“ von MOE hinzugefügt und minimiert, Glu214 und Cys215 wurden stattdessen auf 1HZH.pdb modelliert, um ihre Ausrichtung mit der aktivierten Option „Vorlage überschreiben“ beizubehalten. Ser216 wurde hinzugefügt, sobald das chimäre Modell erstellt und zusammen mit der angrenzenden Disulfidbindung minimiert wurde, um die Stabilität der aglykosylierten Struktur zu bewahren.

Anschließend wurden die Modelle glykosyliert. Wie bereits berichtet20, wurden G0- und G0F-Zucker durch den MOE „Carbohydrate Builder“ Einheit für Einheit an das konservierte Asn297 von Adalimumab (Asn301) angehängt. Ein letzter Minimierungsschritt wurde an den gesamten glykosylierten Modellen durchgeführt, bis der RMS-Gradient 0,01 kcal/mol/Å2 erreichte. Für Avelumab wurden G0F-Glykane, die bereits in der 1HZH-Matrize der MOE-Bibliothek vorhanden waren, nach struktureller Überlagerung und Energieminimierung auf einen RMS-Gradienten von 0,01 kcal/mol/A2 mit dem konservierten Asn297 (Asn300) verknüpft. Um die G0-Modelle zu erstellen, wurde die Fucose aus den Glykanketten der G0F-Modelle gelöscht, dann wurden die Glykane und Asn297 erneut energieminimiert, bis zu einem RMS-Gradienten von 0,1 kcal/mol/A2.

Für jedes Modell (Adalimumab G0 und G0F, Avelumab G0 und G0F) wurden drei 1-µs-cMD-Simulationen unter Verwendung von AMBER2032 als Integrationsmotor und AMBER10:EHT-Kraftfeld33 für insgesamt 3 µs simulierte Zeit pro Antikörper durchgeführt. Zwei von drei MD-Simulationen von Adalimumab wurden bereits in unserer vorherigen Arbeit20 durchgeführt, daher wurden sie erneut analysiert und eine dritte Replik wurde nach demselben Protokoll berechnet. Genauer gesagt wurden die Systeme von MOE konfiguriert und mit dem TIP3P-Wassermodell und NaCl 0,1 M solvatisiert. Der Langevin-Thermostat wurde zur Temperaturregelung eingesetzt, der Monte-Carlo-Barostat wurde zur Einstellung eines konstanten Drucks verwendet und die Simulationen wurden im NPT-Ensemble durchgeführt ( T = 300 K, P = 100 kPa). Die Abtastzeit wurde auf 10 ps und der Integrationszeitschritt auf 2 fs eingestellt. Die Systeme wurden für 5000 Schritte minimiert und eine Aufheizphase für 100 ps durchgeführt. Anschließend wurde vor dem Produktionsschritt eine Äquilibrierungsphase von 100 ps im NVT und eine weitere von 200 ps im NPT-Ensemble durchgeführt. Klicken oder tippen Sie hier, um Text einzugeben. Die XYZ-Zellabmessungen von Adalimumab-Systemen sind: 186,627 × 160,304 × 90,2284 Å (G0) und 185,041 × 161,404 × 90,1505 Å (G0F); für Avelumab: 193,75 × 161,42 × 95,78 Å (G0) und 193,75 × 161,91 × 96,87 Å (G0F).

Für die vier Systeme mit den Kraftfeldern AMBER2032 und CHARMM3634 wurde eine kurze cMD-Simulation von 50 ns Länge durchgeführt, die ausgewählt wurde, um die Dynamik von Zuckern genauer zu untersuchen. Diese Simulationen wurden durchgeführt, um die durchschnittliche potentielle Energie (EPTOT) und die durchschnittliche Diederwinkelenergie (DIHED) zu erhalten, die als Eingabe für aMD verwendet wurden, sowie ein minimiertes und ausgeglichenes Eingabesystem, das für die Produktionsphase von aMD verwendet werden soll . Die Systeme wurden mit CHARMM-GUI35 hergestellt und mit einem kubischen Wasserkasten mit den Abmessungen 181 Å × 3 mit einem minimalen Kantenabstand von 15 Å und NaCl 0,15 M solvatisiert. Jedes solvatisierte System wurde mit einem steilsten Abstiegsalgorithmus für 5000 Zyklen energieminimiert Dabei werden Positionsbeschränkungen auf Proteine ​​und Zucker sowie Diederbeschränkungen auf Zucker angewendet. Die Gleichgewichtsphase wurde für 125 ps im NVT-Ensemble (T = 300 K) mit der Langevin-Dynamik, dem SHAKE-Algorithmus zur Einschränkung der Schwingungen von Wasserstoffatomen und dem Partikelnetz Ewald (PME)36 zur Berechnung elektrostatischer Wechselwirkungen mit einem Grenzwert durchgeführt von 12 Å. Ausgehend von diesen äquilibrierten Systemen wurde für jeden Antikörper eine 1 µs lange aMD-Simulation durchgeführt. Für die AMD-Produktionsphase wurde der Zeitschritt auf 0,002 ps eingestellt, Energie und Koordinaten wurden alle 100 ps gespeichert, das NPT-Ensemble wurde verwendet (T = 300 K; P = 1 bar) mit einer Langevin-Dynamik für die Temperaturregelung und Berendsen-Barostat für Druck, und das gesamte Potenzial wurde zusammen mit einer zusätzlichen Verstärkung der Torsionen erhöht (iamd = 3).

In der Ergänzungstabelle 5 sind die Werte von EthreshD, EthreshP, alphaD und alphaP aufgeführt, die als Eingabe für die Simulationen verwendet und wie in den folgenden Gleichungen berechnet wurden37:

In den Ergänzungstabellen 6 und 7 ist der Aufbau der für cMD- bzw. aMD-Simulationen generierten Systeme angegeben.

RMSD, RMSF und Rg wurden von MDTraj38 für C-Alpha-Atome berechnet. Die cMD-Analyse wurde an den verketteten Replikaten jedes Systems durchgeführt, mit Ausnahme der ersten 300 ns, die als Äquilibrierungsschritte betrachtet wurden. Die Bewegung von Fab-Domänen wurde mittels der Winkel ϕ (Längengrad) und θ (Breitengrad) beschrieben, die in einem mit Fc verbundenen und im Gelenk zentrierten Referenzrahmen definiert wurden, dessen Achsen wie folgt definiert waren: z-Achse kollinear zu Fc und auf Fabs gerichtet, x Achse parallel zu einem Vektor, der die Mitte von Fc (CH2-Regionen) und die durch die Rechte-Hand-Regel definierte Y-Achse verbindet. Für eine detailliertere Beschreibung siehe die Arbeit von Saporiti et al.20 Für den θ-Winkel wurde ein willkürlicher Schwellenwert von 85° gewählt, um zwischen Y- und T-förmigen Konformationen zu unterscheiden. Insbesondere gingen wir davon aus, dass das einzige vollständig kristallisierte menschliche IgG1 (PDB-ID: 1HZH)31, das als T-förmige Konformation39 klassifiziert ist, für beide Fab-Domänen einen θ > 90° aufweist, und wir haben auch die erwartete Konformationsvariabilität berücksichtigt aus MD-Simulationen. Der Abstand zwischen den CH2-Domänen wurde zwischen dem glykosylierten Asn mit MDTraj38 gemessen. Anschließend wurden Boxplots erstellt, um die statistische Signifikanz der beobachteten Werte in den insgesamt 21.000 Bildern zu bewerten. Für das aMD wurde ein Nachwägungsverfahren gemäß den von Miao et al.40 beschriebenen Methoden angewendet, wobei die Maclaurin-Expansion zur 10. Ordnung verwendet wurde, um die freie Energieoberfläche des Systems als Funktion der θ-Winkel anzunähern. Die RMSD-Matrizen für die Clusteranalyse (sowohl von cMD als auch von aMD) wurden mit CPPTRAJ41 generiert, während die Cluster mithilfe eines angepassten Skripts basierend auf dem GROMOS-Algorithmus42 ermittelt wurden. Bei Antikörpern wurden C-Alpha-Atome für die Analyse berücksichtigt, bei Glykanen hingegen die Sauerstoffatome, die an glykosidischen Bindungen beteiligt sind. Für die Antikörper in cMD und aMD wurde ein RMSD-Schwellenwert von 7,5 Å bzw. 6,5 Å verwendet, und die maximale Anzahl von Clustern wurde auf 15 bzw. 10 festgelegt. Für die Clusterbildung von Glykanen wurde der RMSD-Schwellenwert auf 1 Å und die maximale Anzahl von Clustern auf 10 festgelegt. Die wesentliche Dynamik (ED) wurde anhand der Gesamttrajektorien mit dem Kovarianzanalysetool von GROMACS 2020.120,43 berechnet. Anschließend wurden die resultierenden Trajektorien, die entlang des ersten und des zweiten Eigenvektors projiziert wurden, durch die Frames gefiltert, die im Energieminimum enthalten waren, das aus dem FES identifiziert wurde (berechnet als Funktion der θ-Winkel) und zur Berechnung der Δϕ-Verteilung verwendet wurden. Der Mindestabstand zwischen Glykanketten wurde von CPPTRAJ41 und dem Tool „nativecontacts“ mit der Option „mindist“ berechnet, während der Abstand zwischen dem Massenschwerpunkt jeder Kette und sich selbst mit dem Tool „Distance“ berechnet wurde. Für Letzteres wurden die Flugbahnen auf dem Fc vorab ausgerichtet. Die Kontakte zwischen LCs und der Gelenkregion wurden von CPPTRAJ41 mit dem Tool „nativecontacts“ unter Berücksichtigung schwerer Atome und eines Schwellenabstands von 4 Å berechnet. Die Analyse der Wasserstoffbrückenbindungen (H-Brücken) wurde mit einem maßgeschneiderten Python-Skript berechnet, das auf dem H-Brücken-Identifizierungstool MDTraj20 basiert.

Für jede Bedingung wurden drei Replikate der cMD-Simulation durchgeführt. Die Analysen der cMD-Trajektorien wurden unter Einbeziehung der letzten 7000 Bilder jedes Replikats berechnet. Replikate wurden zusammengeführt, um eine Gesamtzahl von Frames n = 21.000 pro System zu erhalten. Die Analysen der AMD-Simulationen wurden für die minimalen Energierahmen durchgeführt, d. h. n = 2649 für Adalimumab G0, n = 3440 für Adalimumab G0F, n = 3170 für Avelumab G0, n = 4110 für Avelumab G0F. Informationen zur Reproduzierbarkeit der Analysen finden Sie in den Quelldaten hinter den Diagrammen in Abb. 1 (a, b, d) und Abb. 5 (a, b), die in den Zusatzdaten 1 enthalten sind. Informationen zur Reproduzierbarkeit der Studie finden Sie unter die Eingabedateien, die Topologien und die Startkoordinaten der in den Ergänzungsdaten 2 enthaltenen Systeme.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Fabio Centola, Ivano Eberini.

Abteilung für Pharmakologische und Biomolekulare Wissenschaften, Universität Mailand, Via Balzaretti, 9, 20133, Mailand, Italien

Simona Saporiti, Tommaso Laurenzi, Uliano Guerrini, Giulia Benigno, Luca Palazzolo, Omar Ben Mariem und Linda Montavoci

Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Mailand, Abteilung für Allgemeine und Organische Chemie „A. Marchesini“, Via Venezian, 21, 20133, Mailand, Italien

Crescenzo Coppa

Biotech-Entwicklungsprogramm, Merck Biopharma, Aubonne, Schweiz

Wolf Palinsky

Global Analytical Pharmaceutical Science and Innovation, Merck Serono SpA, Rom, Italien

Mara Rossi & Fabio Centola

Abteilung für Pharmakologische und Biomolekulare Wissenschaften und DSRC, Universität Mailand, Via Balzaretti, 9, 20133, Mailand, Italien

Ivano Eberini

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Korrespondenz mit Fabio Centola.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Rajarshi Roy und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Saporiti, S., Laurenzi, T., Guerrini, U. et al. Einfluss der Fc-Kernfucosylierung und des Leichtketten-Isotyps auf die IgG1-Flexibilität. Commun Biol 6, 237 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04622-7

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Eingegangen: 03. Oktober 2022

Angenommen: 21. Februar 2023

Veröffentlicht: 3. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04622-7

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